Amélioration de la méthode d’extraction d’ADN génomique au CTAB appliquée aux feuilles de la vigne

Abstract

Le but de notre travail était une optimisation et une validation d’une méthode d’extraction d’ADN génomique afin d’obtenir un ADN de bon rendement et de bonne qualité, selon les moyens disponible dans notre laboratoire d’El-Hadjeb, en comparant les résultats des concentrations et des rendements obtenus du protocole optimisé avec celui avant optimisation. Nous avons pu améliorer le protocole de référence et les résultats étaient satisfaisants, avec l’utilisation des feuilles déshydratées et conservées à température ambiante, qui sont préparées par des simples moyens de notre laboratoire, un séchage à l’aide d’une étuve ventilée et broyage dans un mortier sans utilisation de l’azote liquide. Pour faire une extraction d’ADN génomique efficace avec un bon rendement, nous avons modifié les concentrations du tampon de lyse, avec l’ajout du tween 20 et la protéinase K qui améliorent l’extraction d’ADN et une incubation pendant 60 minutes à 58°C, une incubation avec l’isopropanol à (-20°C) est effectué pendant une nuit et l’ADN obtenus est resuspendu dans 60 μl d’eau bidistillé. Un double lavage avec le chloroforme-alcool isoamylique a été ajouté pour augmenter la pureté de l’ADN extrait. Pour garder l’intégrité de l’ADN, les nucléase sont bloquées dès la préparation des feuilles jusqu’à l’obtention d’ADN génomique. La quantité et la qualité de l’ADN génomique extrait sont étudiées par visualisation sur gel d’agarose au BET, et spectrophotométrie. Une bonne concentration (3975 μg/ml) de l’ADN ainsi qu’un bon rendement (2385 μg/g) ont été obtenus par le protocole optimisé avec un faible coût d’extraction (23,02 DA). Pour la continuité de notre travail expérimental nous proposants: - Augmenter le nombre des échantillons pour faire une étude sur l’efficacité des méthodes d’extraction, ce qui va nous permettre d’en tirer des conclusions et dégager des recommandations, très utiles sur ce protocole optimisé; - Mesurer précisément la quantité et la qualité d’ADN extraits, en effectuant un dosage au Nanodrop et par fluorimètrie; - Valider les résultats positifs obtenus via la PCR afin de confirmer la qualité d’ADN obtenu; - Faire un séquençage et création des cartes génomiques de la vigne algérienne.